禽流感紅細胞凝集抑制實驗詳細步驟
一:實驗前準備
1. 抗原:根據指定免疫類型從生物公司購買穩定的濃縮抗原
2. 抗凝劑的配制:用分析天平稱取3.8克檸檬酸三鈉,溶解于100毫升生理鹽水中,待溶解完全后即可使用。
3. 1%紅細胞懸液制作:去菜市場找殺雞的,去找他們用試管接新鮮雞血,試管中提前加入抗凝劑,加入的抗凝劑與你所接血液的比例大概為1:2,并迅速混勻,在離心機中以3000轉離心五分鐘,用吸管吸取上清液和紅細胞上層的白細胞薄膜,將沉淀的紅細胞加生理鹽水,慢慢混合均勻,不要弄碎了紅細胞,再在離心機中3000轉離心五分鐘,棄去上清,再加生理鹽水混勻,如此往復四到五次。最后一次離心后,去掉上清,管低即為紅細胞泥,用吸管吸取0.1毫升紅細胞泥,然后加入9.9毫升的生理鹽水就是1%的紅細胞懸液,現用現配不要長時間存放。
4. 被檢血清:鄉鎮送來的血液,離心取上清即為被檢驗血清,注意做標記,一管一標記,別弄混了。
5. 血清稀釋液:為滅菌生理鹽水,即高壓過的生理鹽水
二:實驗步驟
血凝(HA)實驗目的是測定抗原效價,即為了制作后面的四單位抗原
1.首先用微量移液器向96孔V型板的每一孔加生理鹽水25微升
2.用微量移液器吸取待測抗原(就是你買的抗原)的25微升于第一孔中并且擠壓六次混合,后吸出25微升至第二孔,依次倍比稀釋到第11孔,11孔中棄去25微升。這一過程最好一孔一換針頭。
3.用微量移液器再吸取1%紅細胞懸液一次加入各孔,每孔25微升
4.置于微量振蕩器上震蕩一分鐘
5.室溫靜置30分鐘觀察結果
6. 結果觀察:
將反應板傾斜成45度角,沉于底的紅細胞沿著傾斜面向下呈線狀流動者為沉淀,表明紅細胞被或者不完全被病毒所凝集:
如果孔底的紅細胞鋪平孔底,凝集成均勻薄層,說明被病毒凝集。
能使雞紅細胞完全凝集的抗原最高稀釋濃度,成為該抗原滴度紅細胞凝集效價,即這個比例稀釋的抗原就是一單位的抗原。比如第八孔紅細胞完全凝集,但第九孔紅細胞不凝集,那么這個抗原的效價為1:256。
也就是你買來的抗原稀釋256倍為一單位抗原,那么稀釋64倍就是四單位抗原。
四單位抗原校正:
1. 就是你依照上個實驗所作出的抗原效價來配置,比如假設上一步抗原效價為1:256,那么四單位抗原就是256除以4為64倍稀釋濃度的抗原,也就是你將買來的抗原稀釋64倍就是四單位的抗原,但是你買的抗原不同,雞紅細胞的本身原因,計算出的抗原效價不同,所以你必須先做抗原效價的計算。
2. 首先用微量移液器向反應板的第二孔至第六孔加生理鹽水25微升,第一孔不加。
3. 用微量移液器吸取四單位抗原25微升分別加入第一孔,第二孔,從第二孔開始擠壓六次混勻,后從第二孔吸出25微升至第3孔,依次倍比稀釋到第五孔,棄去25微升。
4. 用微量移液器再吸取1%紅細胞懸液依次加入1到6孔,每孔25微升。
5. 在微量振蕩器上震蕩一分鐘。
6. 室溫靜置30分鐘觀察結果
7. 如果照上面的結果來計算,如果第四孔發生百分之五十紅細胞沉淀而第五孔完全凝集,那么久說明四單位抗原制作準確。
血凝抑制實驗(HI):每排只能查一份血清,步驟如下
1. 用微量移液器先加25微升生理鹽水在每個孔中
2. 用微量移液器吸取待檢測血清25微升于第一孔中,然后倍比稀釋至第11孔,(就是稀釋原則跟上面的一樣),最后11孔棄去25微升,最后第12孔不加血清,作為對照試驗。
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